Santa Ana de los Guácaras está ubicada a unos 15 km de la capital provincial, en el departamento San Cosme. Fue fundada alrededor de 1621, como una reducción gobernada por los frailes franciscanos, que se pobló con nativos guácaras. En la población se asentaron parte de los nativos que pudieron huir de la destrucción de Concepción de Buena Esperanza. Hoy desaparecidos (aunque hubo mestizaje), entre los pocos rastros que se conservan de su cultura están las tallas elaboradas para la iglesia de Santa Ana, construida en 1771; la iglesia fue destruida en diciembre de 1821 en una invasión paraguaya ordenada por Gaspar Rodríguez de Francia, en la que tropas al mando del comandante de Itapúa, Norberto Ortellado, derrotaron al cacique guaraníes Nicolás Aripí en la última batalla librada por un ejército íntegramente conformado por nativos guaraníes.